| Luisa Godoi Pitol
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José Luiz de
Souza
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Prof. Dr. Jesus Djalma
Pécora
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Descalcificação / Preparo das soluções / Cortes e coloração / Histo-resina
Descalcificação de dentes humanos
Para que se possa examinar os tecidos dentais (dentina, cemento ), deve-se antes de incluir e cortar os tecidos, proceder-se a desmineralização ou descalcificação, método que consiste na remoção do cálcio tecidual, sem alterações na estrutura celular. Para descalcificar dentes humanos podem ser utilizados vários agentes descalcificantes e, citaremos algumas fórmulas:
Ácido Nítrico a 5%:
Para preparar ácido nítrico a 5%, proceda-se do seguinte modo:
O
ácido deve ser colocado muito lentamente na água. Nunca coloque
a água no ácido.
Ácido Clorídrico a 5%
Essa solução descalcifica bem os dentes humanos e apresenta a seguinte fórmula:
A descalcificação dos dentes humanos
Os dentes, de acordo com cada trabalho e dependente do que vai ser pesquisado, devem ser colocados em uma solucão formol a 10%, por no mínimo de 48 horas.
Após a fixação, pelo formol, os dentes devem ser lavados em água corrente, por um período de 20 minutos.
Decorrido o tempo de lavagem em água, os dentes são colocados em recipientes de vidro com capacidade para 20 ml e , a seguir, o ácido escolhido é colocado nesse recipiente, que será trocado a cada 24 horas, até o dente estar descalcificado.
O tempo de descalcificação dependerá da temperatura ambiente. Quanto maior for a temperatura, mais rápida é a descalcificação.
Para testar se a descalcificação está no estado desejado, utilize um alfinete e virifique se ele penetra sem grande esforço, na peça.
Uma vez completada a descalcificação, os dentes estão preparados para inclusão em parafina.
Veja o novo método de descalcificação magnetrônica
Preparo da parafina
Pegar um quilo de parafina e acrescentar 10 gramas de cera de abelha, a mistura deverá ser colocada em um recipiente de vidro (balão) e em seguida aquecida à 70 graus centígrados, em uma estufa. Após a completa liquefação da mistura, a parafina está pronta para ser utilizada.
Preparo do dispositivo de papel para receber a parafina e o dente: (forma)
O dispositivo para incluir o dente em parafina pode ser uma forminha das utilizadas para colocar doces, porém, explicaremos aqui, como preparar uma forma de papel:
Soluções utilizadas para a coloração dos dentes em H.E.
Hematoxilina (Harris)
Solução de estoque de Floxina a 1%
Solução Eosina-Floxina
Esta solução deve ser preparada para ser utilizada no máximo entre 7 a 15 dias e deve ser preparada do seguinte modo:
Solução de Scott
Para preparar a solução de Scott, coloque a água destilada em um recipiente e a seguir coloque os demais componentes da fórmula.
Solução Álcool/Ácido
Prepare esta solução do seguinte modo:
Coloque em um recipiente 99 mililitros de álcool 70 Gl e adicione 1 mililitro de ácido clorídrico concentrado.
Solução Álcool/Xilol
Misturar 250 ml de Álcool 96 GL com 250 ml de Xilol.
Preparo dos Cortes e Processo de Coloração
1) Após a descalcificação, deve-se estabelecer, de acordo com a pesquisa o tipo de corte que o dente vai receber: sagital ou transversal. Caso o dente vá receber corte sagital, ele pode, para facilitar o processo ser seccionado transversalmente nos terços cervical, médio e apical.
2) Lavar os dentes ou os terços dos dentes em água corrente por meia hora.
3) Neutralizá-los em uma solução de sulfato de sódio a 4%, durante 15 minutos.
4) Lavar em água corrente por 10 minutos.
5) Desidratação:
Esquema:
Álcool 96º |
Álcool 100º |
Álcool 100º |
Álcool 100º |
Álcool 100º |
6) Clarificação:
Dois banhos em Xilol ou Benzol por 30 minutos cada.
Esquema:
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Xilol ou Benzol |
Xilol ou Benzol |
7) Parafinização:
Primeiro banho de Parafina 70 ºC por 2 horas. |
Segundo banho de Parafina 70 ºC por 2 horas. |
8) Montagem dos dentes em blocos de parafina:
Colocar os blocos de parafina com os dentes incluídos, em uma geladeira por meia horas.
Na geladeira, os blocos podem ficar até o momento de uso.
9) Corte no micrótomo
Para cortar estruturas dentais os cortes podem ser de 5 ou 6 micrometros de espessura.
Após os cortes, pegar a fita de parafina que contém os cortes e colocá-la em água, em um recipiente de Banho-Maria a 37°C. Deixar os cortes esticarem. Após os cortes estarem bem esticados, pegá-los por meio da lâmina de vidro para microscopia própria.
Colocar as lâminas com os cortes histológicos em uma placa aquecedora (37°C) e deixá-las secar por 15 minutos e, a seguir, colocá-las na estufa a 70°C, por 30 minutos.
10) Desparafinização e coloração:
1º banho de xilol |
1º banho de xilol |
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Álcool 100 (1º banho) |
Álcool 100 (2º banho) |
Álcool 96 GL |
10.4) Corar em hematoxilina (tempo de 3 a 5 minutos)
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Corar hematoxilina (tempo de 3 a 5 minutos) |
10.6) Passar as lâminas por uma solução álcool-ácida por 20 segundos
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Solução álcool-ácida (20 segundos) |
10.8) Mergulhar as lâminas na solução de Scott
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Mergulhar as lâminas na solução de Scott |
10.10) Passar rapidamente as lâminas em álcool 96GL
10.11) Colocar as lâminas no recipiente que contém Eosina-Floxina por 40 segundos.
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Solução de Eosina-Floxina por 40 segundos |
10.13) Passar as lâminas em quatro alcoóis absoluto, sendo dois minutos em cada álcool.
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10.15) Passar as lâminas no xilol por dois minutos e a seguir, deixá-la em outro recipiente com xilol, até a hora da montagem.
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Solução de álcool-xilol |
Banho de xilol por dois minutos |
Solução de xilol permanecer até o momento da montagem |
11) Montar as lâminas:
Colocar sobre os cortes histológicos o Entellan (Merck) ou o bálsamo do Canadá e colocar a lamínula.
Método de coloração Gran
Violeta:
Pesar 1 grama de cristal de violeta e dissolver em 100 ml de água destilada.
Bicarbonato de sódio:
Pesar 5 gramas de bicarbonato de sódio e dissolver em 100 ml de água destilada.
Iodo:
Colocar um grama de iodo e dois gramas de iodeto de potássio em 300 ml de água destilada.
Solução Eter/acetona1:1 (colocar 50 ml de eter em 50 ml de acetona)
Solução de acetona/xilol 1:1 (colocar 50 ml de acetona em 50 ml de xilol)
Fucsina básica: Pesar 0,25 grama de fucsina básica e colocar em 100 ml de água destilada. Assim preparada, pegue 10 ml dessa fucsina e misture com 90 ml de água destilada. Essa diluição será utilizada para corar.
Na
hora de usar, pegar 20 ml da solução preparada de violeta
e 5ml da solução de bicarbonado de sódio.
Ácido pícrico:
Preparar um solução saturada.
Modo de corar Browm Bren:
2) Colocar as lâminas da solução preparada de iodo por um minuto. Lavar em água destilada e secar em papel de filtro ou guardanapo, rapidamente.
3) Colocar na solução eter/acetona para diferenciar, mergulhar (por e tirar). Lavar em água destilada.
4) Colocar as lâminas em fucsina preparada por um minuto e em seguida lavar em água destilada.
5) Colocar as lâminas na solução de ácido pícrico por um mintuto, lavar em água destilada e secar em papel.
6) Colocar as lâminas em acetona pura, mergulhar (por e tirar).
7) Colocar as lâminas em acetona/xilol mergulhar (por e tirar).
8) Colocar em xilol I, II e III
9) Montar em bálsamo.
INTRODUÇÃO AO USO KULSER (HISTO-RESINA)
O uso de resina de metacrilato (TECNOVIT 7100) foi introduzido no sistema de inclusão e microtomia para preparos histológicos com a possibilidade de se obter cortes finíssimos de até 1 micrometro. A resina infiltra de maneira completa e homogêna em todos os componentes dos tecidos. Sua aplicação tem sido muito difundida.
Essa resina sintética (TECHNOVIT) contém hidroximetil metacrilato (HEMA) é muito tóxica, sendo irritante para os olhos, pele e trato respiratório. Ao utilizá-la, o profissional deve tomar todo cuidado para não deixá-la entrar em contato com os olhos e a pele. O local de trabalho deve possuir boa ventilação e, ainda ser dotado de sistema de exaustão, para evitar a inalação dos vapores da resina, que é volátil.
A resina TECHNOVIT 7100 (líqüida) polimeriza uniformemente à temperatura ambiente quando se utiliza as proporções indicada pelo fabricante. A polimerização ocorre a entre 35 oC e 38 oC, quando se utiliza o Histoform's e ante 40 oC e 45 oC, quando se utiliza o Histoform Q
A elasticidade do TECNOVIT 7100 possibilita cortes finíssimo em um micrótomo de alta qualidade. As navalhas descartáveis HISTO-KNIFE da marca KULZER.
O estiramento dos cortes é bom e rápido e cumpre salientar que ele deve ser realizado em água fria.
A coloração dos tecidos é possível ser realizada em curto tempo e com grande qualidade em todos os métodos conhecidos.
O líqüido (HARNER II) contém dimetilsulfóxico e é higroscópico, portanto o frasco deve ser fechado imediatamente após a retirada da quantidade necessária para o trabalho. (Hardner I) contém peróxido de benzoila, Deve-se fechar hermeticamente o frasco, pois o produto é muito tóxico. Manter os frascos em local fresco, ventilado. esses componentes tem vida média de um ano, quando conservada à temperatura ambiente.
Todas as superfícies que vão entrar em contato com o TECNOVIT devem estar limpas e desengorduradas. Para a limpeza das superfícies, que receberão a resina, devem ser limpas com um dos seguintes produtos: tricloroetileno, percloroetileno ou benzina. Para a inclusão deve-se utilizar bases de polietileno ou borracha de silicone.
Para aplicar essa técnica utiliza-se os seguintes acessórios:
Preparação dos tecidos
Realiza-se a fixação dos tecidos a serem analisados, de maneira habitual e, a desidratação, segue-se as normas de rotina do laboratório.
Para a diafanização utiliza-se uma mistura de TECNOVIT preparada do seguinte modo:
Colocar 100 ml de TECNOVIT em um frasco e adicionar 1 saquinho de HARDNER I. essa solução, assim preparada, tem uma vida útil de quatro semanas e dura por mais tempo se for mantida em geladeira.
Os tecidos são mantidos nesta solução diafanizadora por um tempo que varia de 1 a 12 horas, dependendo da espessura das amostras e classe dos tecidos. As peças a serem analizadas são colocadas em em moldes individuais que contém 1 ou mais ml da solução diafanizadora. As peças devem ser agitadas, na posição desejada.
Após obtida a diafanização das peças, a inclusão é realizada com o mesmo líqüido diafanizador, com a adição de um endurecedor: HARDNER II
Para preparar o líqüido de inclusão faz-se o seguinte:
Pega-se 15 ml da solução preparada para a diafanização e adiciona-se 1 ml do endurecedor (HARDNER II) sob agitação constante até total mistura. Para esse intento deve-se utilizar vidraria graduada de alta qualidade e precisão. O tempo para essa preparação é de 3 a 4 minutos, pois a partir desse tempo, inicia-se a polimerização da resina.
À temperatura de 23 oC, as amostras preparadas polimerizam de forma homogênea e com pequeno desprendimento de calor, num tempo que varia de 60 a 120 minutos no HISTOFORM'S ou num tempo que varia de 100 a 120 minutos no HISTOFORM Q.
Após a adição do HARNER II, o tempo de trabalho é de apenas 5 minutos. No caso da solução de inclusão parecer endurecida para os propósitos, pode-se adicionar 5% de polietileno glicol 400 para amolecer a solução e retardar o endurecimento.
Montagem:
Para fixar o bloco obtido, ao suporte de encaixe no micrótomo pode-se utilizar o TECHNOVIT 3040, que é preparado do seguinte modo:
Misturar 2 volumes de TECNOVIT 3040 (pó) para 1 volume de TECNOVIT líqüido. Pegar 2 ml desse preparado e colocar na base do bloco já pronto e sobre ele, o suporte. Após 5 ou 10 minutos pode-se remover o bloco e proceder a microtomia.
Microtomia:
Pode-se obter cortes histológicos de até 1 micrometro de espessura e em geral, não há necessidade de se aparar os cortes em líquido como na microscopia eletrônica. Mas se isto for desejável pode-se utilizar liqüido que não seja diluente pra a resina. pode-se utilizar alcool metílico diluido em pequena quantidade de água.
Os procedimentos posteriores, tais como: montagem dos cortes nas lâminas, colorações, etc, devem seguir os métodos rotineiros utilizados no laboratório. Não há necessidade de desplastificar os cortes histológicos.
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